Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3

В то же время для моновольтинных видов, дающих в природе только одно поколение в год либо в пару лет, внедрение такового подхода не представляется вероятным, так как получение резистентных генотипов в лаборатории подразумевает посемейный Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 отбор в ряду как минимум 10-20 поколений, что, в свою очередь, просит долголетней работы. При всем этом начальные особи насекомых должны быть чувствительными к инсектициду. Не считая того, при доминантном нраве наследования признака гетерозиготные Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 самки (самцы) при скрещивании будут опять давать расщепление по данному признаку.
В этой связи нами был применен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам генотипов. Он не просит проведения Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 многоступенчатого, в ряду нескольких генераций, процесса селекции и неизменного посемейного отбора особей, резистентных к инсектициду. Предлагаемый нами подход состоит в том, что подборку из природной популяции обрабатывают определенной концентрацией инсектицида и наблюдают Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 динамику смертности насекомых, отбирая при всем этом особей погибших первыми (чувствительные) и погибших последними, либо оставшихся в живых, зависимо от применяемой концентрации инсектицида (устойчивые). При всем этом количество отобранных особей должно быть менее Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 10% от объема подборки. Не считая того, исследуемая популяция насекомых должна находиться в неизменном содействии с инсектицидами и иметь высочайший показатель (уровень) резистентности, что априори подразумевает наличие резистентных генотипов в исследуемой выборке. Данный подход позволил Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 нам отобрать резистентные к инсектицидам генотипы из природной популяции моновольтинного вида - клопа вредная черепашка E. integriceps.

С внедрением имеющегося у нас набора RAPD-праймеров нами было получено 280 ДНК-маркеров, но только по Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 восьми из их найдены отличия меж 2-мя группами насекомых, а более соответствующие – по двум ДНК-фрагментам (набросок 5).

Так устойчивые к инсектициду особи характеризовались более высочайшей частотой встречаемости ДНК-маркера OPA Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 318/520, также наличием маркеров OPA07/410 и OPA06/470 при отсутствии таких у чувствительных особей. В свою очередь для чувствительных особей было типично 100%-ное присутствие маркера OPA06/430 при практическом отсутствии его у устойчивых особей и поболее Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 высочайшая частота встречаемости маркеров OPA18/400, OPA07/470, OPA07/450. Более соответствующие различия меж 2-мя подборками следили по праймеру OPA06 (RAPD-маркеры 470 и 430 п. н.).

Можно было заключить, что устойчивость/чувствительность к инсектициду Би-58 определялась в Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 этом случае присутствием 2-ух основных RAPD-локусов, по которым отличались определенные генотипы. Присутствие 1-го из маркеров, обычно, сопровождается отсутствием другого, что, возможно, показывает на существование определенной связи меж маркируемыми локусами Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3. Более того, полностью возможно, что исследуемый признак контролируется огромным числом генов и маркируется соответственно огромным числом ДНК-


1 2 3 4 5 6 7 8 М 9 10 11 12 13 14 15 16 17


470 п.н

430 п.н.



Набросок 5 – RAPD-фенотипы клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3-58 (праймер ОРА06). Дорожки: 1-8 – чувствительные особи; 9-17–устойчивые особи. М – Маркеры молекулярных масс Pst1)


фрагментов. В целом воздействие инсектицида Би-58 Новый на молекулярно-генетическую структуру и гетерогенность краснодарской популяции клопа вредная черепашка было очень Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 значимым. Оценка по более весомым RAPD-маркерам меж 2-мя исследуемыми подборками насекомых (чувствительные/устойчивые)показала, что коэффициент генетического сходства меж ними был незначителен и составил 0,61 (по Nei, 1978). Принципиально отметить также, что Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 наблюдаемое генетическое обилие клопов в резистентной выборке было (так же, как и для резистентной популяции яблонной плодожорки) достоверно меньше, чем у чувствительных особей (таблица 9). Это полностью объяснимо, потому что действие инсектицида ведет к Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 элиминации чувствительных особей, а, как следует, и к понижению гетерогенности популяции в целом, выявляемой а именно по отдельным ДНК-локусам.

Таким макаром, воздействие инсектицида Би-58 Новый на клопов вредной черепашки сопровождается переменами Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 в молекулярно-генетической структуре и понижением генетического контраста популяции. Поиск ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам у моновольтинных видов природных популяций вредителей, повсевременно взаимодействующих с инсектицидами, рекомендуется проводить с внедрением предлагаемого нами подхода. RAPD Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3-метод позволяет оценить различия по чувствительности к инсектицидам у клопа вредная черепашка и выявить резистентные к инсектицидам генотипы.

В то же время из-за низкой воспроизводимости RAPD-маркеров к их использованию для целей Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 мониторинга резистентности нужно подходить с осторожностью. Чтоб избежать ошибки опыта опыты нужно ставить в нескольких аналитических повторностях, а сравнительный анализ ДНК проводить с одним набором реактивов, на одном амплификаторе, в Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 одной ПЦР. Не считая того, для большей репрезентативности нужно следующее


Таблица 9 – Генетическое обилие и частота встречаемости отдельных RAPD-локусов в подборках клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58


RAPD-локус

Чувствительные

Устойчивые

ОРА18/520

0.25

0,50

OPA18/450

0,50

0,06

OPA Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 307/470

0,25

0,10

OPA07/450

0,21

0,06

OPA07/430

0,29

0

OPA07/410

0

0,34

OPA06/470

0

1,0

OPA06/430

1,0

0,03

Генетическое обилие по Nei (h ± σ)

0,25 ± 0,21

0,17 ± 0,19*

Индекс Шеннона (I ± σ)

0,37 ± 0,31

0,28 ± 0,26

*- tфакт.≥t05 - достоверно отличаются от чувствительных


преобразование RAPD- в SCAR-маркеры (sequences-characterized amplified region). В этой связи

приобретенные данные Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 носят только подготовительный нрав, в то же время это не понижает значимости самого подхода. В итоге результаты схожих тестов могут дать в руки исследователю дополнительный инструмент контроля за развитием резистентности насекомых к инсектицидам и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 посодействуют лучше осознать механизмы формирования этого процесса.


^ Глава 6. Исследование экологической безопасности трансгенных растений с внедрением фенетических и ДНК-маркеров

Создание трансгенных либо на генном уровне измененных растений (ГМР) в конце Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 прошедшего века и активное их внедрение в мировом сельскохозяйственном производстве ставит вопрос об их экологической безопасности. Это равным образом относится и к Bt-защищенным растениям, с признаком стойкости к вредным насекомым и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 а именно к Bt-картофелю, устойчивому к колорадскому жуку.

    1. ^ Мониторинг резистентности колорадского жука к Bt-картофелю

В почти всех работах доказана связь адаптивности популяций колорадского жука к инсектицидам с рисунком центральной части переднеспинки Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 имаго [Кохманюк, 1982; Фасулати, 1986; Повелитель, Новосельская, 2001]. Вот почему нам казалось естественным изучить возможность оценки резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю (растение-инсектицид) по фенетическим маркерам, что может являться основой для более обычного Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 способа мониторинга популяций этого вредителя.

В задачку данного шага исследовательских работ входило исследование изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука под действием Bt-картофеля и на этой базе поиск фенетических маркеров резистентности. Для исследования Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 связи чувствительности популяций колорадского жука к Bt-картофелю и их фенетической структуры мы оценивали частоту встречаемости феноформ под воздействием трансгенного картофеля и чувствительность к Bt-токсину у ряда популяций Краснодарского края.

По Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 приобретенным данным нами проведена формализация исследуемой зависимости, на основании которой можно оценить длительность жизни личинок колорадского жука (IV возраста) от частоты встречаемости феноформы «V»:

5, если Х ≤ 6,5;

Y= 5 + 1,4 (Х-6,5), если Х ≥ 6,5,


где Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 Y - длительность жизни личинок колорадского жука IV возраста (сут); Х – частота встречаемости феноформы «V» (%).


Предложенная математическая модель довольно правильно обрисовывает исследуемые закономерности в данной группе популяций. Может быть для других популяций колорадского жука Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 предложенная модель может быть изменена. В то же время это не понижает значимости самого подхода, но только конкретизирует необходимость проведения подобных мероприятий для тех популяций и в тех зонах возделывания, где планируется обрабатывать Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 Bt-сорта.

Таким макаром, мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt–чувствительности фенокомплекс «V» и прогноз развития резистентности по Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 разработанной формуле расчета.

В то же время мы осознаем, что морфологический анализ и построенная на нем система мониторинга не может являться полностью достоверной, тем паче в виду наличия значимой модификационной изменчивости фенетических Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 маркеров в меняющихся критериях наружной среды. Вот почему мониторинг по ДНК-маркерам, как нам кажется, будет более достоверным, хотя, непременно, и поболее дорогостоящей процедурой. В то же время, данный подход также может иметь право Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 на жизнь. Возможно, совместное внедрение всех доступных способов позволит проводить действенный мониторинг резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по морфо-генетическим аспектам.

6.2 Воздействие Bt-картофеля на молекулярно-генетическую Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 структуру популяций и жизнеспособность нецелевых видов насекомых

Одним из экологических рисков является вероятное негативное воздействие ГМР на нецелевую биоту, что может плохо отразиться на биоразнообразии видов и в том числе нецелевых насекомых биоценоза. В Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 текущее время исследователей и общественность тревожит приемущественно вопрос не острой токсичности ГМР, но пролонгированного деяния Bt-растений на нецелевые виды биоты [Соколов и др., 2005]. Вправду, длительное воздействие Bt-токсинов (в ряду нескольких генераций Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 насекомых) может сказаться на внутрипопуляционной структуре и генетическом многообразии популяций организмов, населяющих биоценоз Bt-картофеля и питающихся листьями, клубнями либо пыльцой трансгенного растения. Это, в свою очередь, может отразиться на адаптивности Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 популяций и в итоге на виде в целом.

Не считая того, воздействие Bt-токсинов может привести не к элиминации, а напротив, к повышению жизнеспособности насекомых, относящихся к нецелевой группе. Применительно к вредителям данное явление Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 очень не нужно, потому что безизбежно скажется на росте их численности и соответственно на урожае картофеля. Эти нюансы биобезопасности ГМР по сей день оставались вне поля зрения ученых и добивались Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 собственного рассмотрения.

Целью данного шага исследовательских работ являлось изучить воздействие Bt-токсинов на некие нецелевые виды насекомых, населяющих биоценоз трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, в ряду первых нескольких генераций. В этой Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 связи ставилась задачка провести сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры и генетического контраста а именно популяции картофельной минирующей моли при питании начальным и трансгенным (Bt) картофелем. Не считая молекулярно-генетических исследовательских работ ставилась Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 задачка провести оценку исследуемых 2-ух групп насекомых по неким показателям их роста и развития, при всем этом в анализ планировали включать каждые пять-семь поколений насекомых. Принципиально отметить, что картофельная минирующая Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 моль Phthorimaea operculell, как нецелевой вид для Bt-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, является комфортным объектом для такового рода исследовательских работ, потому что способна плодиться на искусственных питательных средах и в лабораторных Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 критериях может дать до 13 генераций насекомых в год.

Проведенный анализ начальной популяции картофельной моли и первых 20 5 ее генераций на среде с ^ Bt-токсином показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое обилие популяции в Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 критериях питания Bt-картофелем остаются постоянными. Статистически важных различий по показателям роста и развития также отмечено не было [Киль и др. 2008, 2009,2010]. В этом разделе автореферата представлены результаты анализа двадцатой и 20 пятой генерации Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 насекомых, содержащихся на среде с токсином Сry3A.

Опыт проводили в лабораторных критериях. Подборки из популяции насекомых, содержащихся на искусственной питательной среде с листьями начального и Bt-картофеля, анализировали по RAPD- и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 ISSR-маркерам и неким показателям роста и развития. Молекулярно-генетическую структуру обрисовывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по аспекту хи-квадрат и коэффициенту генетического Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 контраста Шеннона (Н) [Chalmers et al, 1992]. После проведения подготовительного скрининга 20 RAPD- и 10 ISSR-праймеров для целей исследования были отобраны более информативные четыре: RAPD-праймеры ОРА07, ОРА20, ОРВ01 и ISSR-праймер UBC810.

Оценка Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 внутрипопуляционного генетического контраста по Шеннону не выявила существенных различий меж исследуемыми подборками насекомых, питающихся обычным и трансгенным (Bt) картофелем. Cравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп насекомых также показал отсутствие статистически Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 важных различий в исследуемых подборках (таблица 10).


Таблица 10 – Изменчивость молекулярно-генетической структуры и генетического контраста в популяции P. operculella при питании начальным и трансгенным картофелем (двадцатая генерация насекомых)



Праймер

Индекс Шеннона (Н)



Аспект хи-квадрат (c Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 32 )


Начальный картофель

Bt-картофель

UBC810

1,87

1,94

1,1

OPA07

3,0

2,66

2,5

OPA20

4,25

4,31

4,9

OPB01

4,25

4,24

5,4

c2факт ≤ c205 – различия не достоверны



Результаты анализа насекомых картофельной минирующей моли, содержащихся при различных критериях питания по неким показателям роста и развития насекомых приведены в таблице 11.

Можно Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 увидеть, что различия меж 2-мя исследуемыми подборками были несущественны: фактические значения аспекта Стьюдента по всем показателям были меньше табличного.

Таким макаром, сравнительный анализ частот встречаемости ДНК-маркеров показал, что молекулярно Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3-генетическая структура и генетическое обилие популяции картофельной моли в критериях питания Bt-картофелем (сорт Луговской плюс) остаются постоянными. Статистически важных различий по показателям роста и развития также отмечено не было. Для Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 оценки пролонгированного деяния трансгенного Bt-картофеля на нецелевых насекомых можно использовать в качестве модельного объекта картофельную минирующую моль по предлагаемой нами методике. Оценку пролонгированного воздействия ГМР на нецелевых насекомых на шаге предрегистрационных испытаний рекомендуется Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 проводить с внедрением предлагаемого нами подхода, в базе которого лежит содержание поливольтинных видов насекомых на искусственной питательной среде, содержащей Bt-токсины (опыт) и начальный сорт (контроль), и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 структуры, генетического контраста и характеристик роста и развития исследуемых 2-ух групп насекомых.

Таблица 11 – Средние значения характеристик роста и развития картофельной минирующей моли в критериях питания Bt-картофелем (20 5-ая генерация)


Сорт картофеля

Количество яиц, отложенных Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 одной самкой, шт

(n=20)

Отрождение гусениц (фертильность яиц), %

(n=20)

Окуклилось гусениц, %

(n=20)

Масса куколок, мг

(n=27)

Количество вылетевших бабочек, %

(n=20)

Длительность развития от яичка до имаго, сут

(n=20)

Bt-картофель (Луговской плюс Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3)

63,51,1

76,91,0

560,7

6,50,6

46,00,7

30,00,2

Начальный картофель

(Луговской)

64,01,3

77,21,1

54,70,8

7,40,9

46,31,0

29,80,2

Аспект Стьюдента

0,29

0,21

1,31

0,75

0,26

0,96

c2факт ≤ c205 – различия не достоверны





    1. ^ Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-культур к их одичавшим сородичам и обычно возделываемым сортам

Одним из качеств экологической безопасности ГМ-культур является оценка риска Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 вертикального переноса генов от ГМ-растений к культурным сортам и одичавшим сородичам. Под вертикальным переносом генов понимают передачу генетического материала в поколениях половым методом. Возможная опасность тут состоит в том, что Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 новые привнесенные признаки стойкости дадут дополнительные достоинства одичавшим видам растений, и будут содействовать их резвому распространению. В итоге это приведет к возникновению так именуемых «суперсорняков» и повышению засоренности полей, что может Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 сделать экологическую делему.

Вопросы риска вертикального переноса генов от ГМ-картофеля и ГМ-кукурузы к их одичавшим сородичам и другим возделываемым сортам также изучены нами с применением способа ПЦР. При всем Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 этом анализ генетической вставки проводили с внедрением SCAR-праймеров, направленных на регуляторные области генома, 35S-промотор (детектируемый кусок размером 195 п.н.), Nos-терминатор (180 п.н.) и мотивированные гены, а именно ген Cry3A Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 Bt-картофеля (117 п.н.).

Результаты тестов по вертикальному переносу генов от Bt-картофеля выявили отсутствие переноса генетической конструкции к одичавшим видам и культурным сортам картофеля. Стоит отметить, что, невзирая на то, что картофель Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 является самоопылителем, перекрестное опыление может составлять у него от 0 до 20 % [Plaisted, 1980]. Если учитывать, что в качестве посадочного материала в нашей стране служат клубни картофеля, а не семечки, можно заключить, что риск вертикального переноса Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 генов от трансгенного картофеля мал. К тому же одичавшие родственники картофеля на местности Русской Федерации не произрастают, а если б и произрастали, гибридные семечки не создавались бы, что подтверждалось плодами наших опытов Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3.

На закрытых сертифицированных участках опытнейших полей ВНИИБЗР был проведен также долголетний опыт по исследованию способности вертикальной передачи генов от раундап-устойчивой кукурузы к обычно возделываемым сортам. В задачку исследовательских работ входило исследование Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 способности переноса пыльцы, дистанция рассеивания пыльцы, определение зоны безопасности и пространственной изоляции при выращивании трансгенной кукурузы.

ПЦР анализ выявил наличие трансгенной вставки у образцов, взятых по разным фронтам переносимой ветром Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 пыльцы (набросок 6). Перенос генов от ГМ-кукурузы к обычно возделываемым сортам следили приемущественно на дистанции 5-10 м, но в отдельных случаях – до 200 м (юго-западное направление).







Набросок 6 - ПЦР-анализ семян кукурузы на наличие трансгенной Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 вставки.


Таким макаром, на основании проведенных исследовательских работ можно заключить, что риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Степень перекрестного опыления меж трансгенной кукурузой и культурными Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 сортами, находящимися вблизи, будет зависеть от ряда причин, таких как расстояние меж ними, локальных барьеров на пути движения пыльцы, местного климата и топографии. Вследствие этого поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены более Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 чем на 200 м от полей с культурными сортами, также нужно создание барьеров на пути движения пыльцы. В Рф одичавшие сородичи кукурузы не встречаются, потому, риск интрогрессии трансгенов от ГМ-кукурузы к ее одичавшим Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 видам в Русской Федерации отсутствует [Крутенко, 2006].

Вопросы ПЦР-детекции и идентификации трансгенов при мониторинге вертикального переноса генов от ГМ-культур плотно сплетены с способами контроля за ГМ-семенами, зерном, растениями и продукцией Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 на их базе. При всем этом встает вопрос не только лишь детекции и идентификации трансгенов, да и их количественной оценки в образчиках.

Полуколичественная оценка ГМИ в семенах сои

Имеющиеся сейчас способы количественной Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 оценки на генном уровне измененных источников (ГМИ) в еде, зерне и кормах основаны приемущественно на применении техники «Real Time RCR». Такая техника исследовательских работ просит использования флуоресцентной метки и дорогостоящего оборудования Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3. Вот почему нами была предпринята попытка количественной оценки ГМИ с внедрением стандартного способа ПЦР, на базе подбора хороших критерий для высокоспецифичной амплификации ДНК [Киль, Крутенко, 2003].

Объектом исследования являлась раундап-устойчивая соя, сорт Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 Stine 2254 RR (Монсанто, США).

На рисунке 7 представлена электрофореграмма товаров амплификации образцов ДНК сои, выделенных из навесок соевой муки с массовым содержанием ГМ-компонента 10,0 %; 5,0 %; 3,0 %; 1,0 %; 0,5 %; 0,01 %.


М


М

М


М


10%

3%

5%

1%

0,1%

0,5%







Набросок 7 - Полуколичественная оценка содержания ГМ-компонента (RR-сои) в соевой Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 муке по мотивированному гену EPSPS (праймеры RR01 и RR04, размер куска 356 п.н.). М-маркеры молекулярных масс (М100 bp).


Можно увидеть отлично различимое изменение интенсивности полос при соответственном изменении концентрации ГМИ в Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 зерне, что позволяет проводить полуколичественную оценку ГМИ в образчиках на базе обычный зрительной оценки. Эти данные, в свою очередь, позволяют выстроить калибровочный график зависимости от концентрации ГМИ в образчике и Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 интенсивности ДНК-фрагмента, используя надлежащие статистические способы и программки, и на этой базе количественно оценить содержание ГМИ в исследуемом образчике.

Таким макаром, подобрана лучшая система полуколичественной оценки ГМИ в семенах сои (в спектре концентраций Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 0,1-10 %), что позволяет проводить резвый и действенный мониторинг ГМ-сои как в агроценозах, так и в сельскохозяйственной продукции на ее базе.


Выводы

В итоге проведенных исследовательских работ можно сделать последующие главные выводы:

  1. Сделаны новые Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 более информативные системы описания фенетической структуры популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.

  2. Чувствительность разных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука. Фенетическая Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 структура популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка сначала определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к разным стрессам, что показывает также на универсальный нрав выявленных закономерностей.

  3. Выявлена сцепленность генов Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 расцветки и рисунка имаго клопов вредной черепашки с полом. Исследование популяционных процессов клопа вредная черепашка по фенетическим маркерам нужно проводить с учетом половых различий.

  4. Выявлена высочайшая модификационная изменчивость фенетической структуры популяции клопа вредная Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 черепашка, что ставит под вопрос внедрение фенетических маркеров при мониторинге резистентности клопов к инсектицидам.

  5. Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 подхода состоит в том, что он не просит проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры резистентности к инсектицидам Би Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3-58 Новый: RAPD-маркеры ОРА06/470 и 430 п. н.

  6. Показано генетическое сходство клопов-черепашек с другими представителям семейства щитников (Pentatomidae), что, по-видимому, показывает на принадлежность этого вида клопов быстрее к семейству Pentatomidae, чем Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 к Scutelleridae.

  7. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt–чувствительности фенокомплекс «V» и прогноз развития резистентности - по разработанной формуле расчета.

  8. Молекулярно-генетический анализ Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 и оценка характеристик роста и развития картофельной минирующей моли свидетельствует об отсутствии положительного / негативного воздействия Bt-картофеля (сорт Луговской плюс) на генетическое обилие, структуру популяции, жизнеспособность и репродуктивные функции этого Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 нецелевого вида насекомых как минимум в первых 20 5 поколениях.

  9. Риск вертикального переноса генов от Bt-картофеля к его одичавшим сородичам и культурным сортам мал, тогда как риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 к культурным сортам существует. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены более чем на 200 м от полей с культурными сортами, при всем этом нужно создание барьеров на пути движения пыльцы.

  10. Разработан Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 способ полуколичественной оценки содержания ГМИ, основанный на амплификации участка мотивированного гена CP4 EPSPS с внедрением пары праймеров: RR01 и RR04, фланкирующих участок мотивированного гена размером 356 п.н., который позволяет проводить не только Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 лишь ПЦР-детекцию и идентификацию трансгенов в зерне и зернопродуктах сои, да и определять их количественное содержание.

^ Практические советы

  1. Для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка предлагается использовать новые Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 системы описания феноформ рисунка и расцветки имаго насекомых.

  2. Для молекулярно-генетического анализа популяций насекомых предлагается использовать разработанную нами методику: «Методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых при помощи ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR)».

  3. Поиск резистентных Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых рекомендуется проводить с внедрением предлагаемого нами подхода, основанного на обработке инсектицидом подборки из природной резистентной популяции.

  4. В целях резвого и действенного Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их базе товаров и кормов использовать предлагаемые нами способы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале.

  5. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены более чем Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 на 200 м от полей с культурными сортами, также нужно создание барьеров на пути движения пыльцы. Изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется.

  6. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному (Bt Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3) картофелю проводить с внедрением предлагаемого нами способа: «Метод оценки чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго».

  1. На шаге предрегистрационных испытаний оценку пролонгированного воздействия трансгенных растений на Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 нецелевых насекомых проводить с внедрением предлагаемого нами подхода и а именно оценку Bt-картофеля - по предлагаемой нами методике: «Методика оценки пролонгированного деяния трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых», основанной на использовании сравнительной оценки генетического контраста Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность - страница 3 и изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.


Перечень работ, размещенных по теме диссертации



teoreticheskie-metodi-praktikum-teksti-dlya-samostoyatelnogo-izucheniya-kazan.html
teoreticheskie-modeli-konkurencii-tablica-2-monografiya.html
teoreticheskie-obosnovaniya.html